期刊：《Aquatic Toxicology》
影响因子：4.96
文章题目：Tylosin toxicity in the alga Raphidocelis subcapitata revealed by integrated analyses of transcriptome and metabolome: Photosynthesis and DNA replication-coupled repair
技术手段：RNA-Seq、LC-MS代谢组学
派森诺生物与西北大学携手合作，于近期在《Aquatic Toxicology》上发表关于羊角月牙藻经过泰乐菌素处理后的转录组学和代谢组学联合分析的相关研究成果。
研究背景
泰乐菌素(TYN)是一种常用的大环内酯类抗生素，可有效对抗革兰氏阳性菌，并可作为兽药用于预防肠道和呼吸道感染。TYN残留物可以通过在农田中施用粪肥和泻湖废水进入环境，值得注意的是，全球地表水中已检测到浓度高达3.06 μg L-1的TYN。已有研究表明，TYN对藻类的生长和发育产生不利影响。TYN能够抑制铜绿微囊藻和羊角月牙藻的叶绿素合成，进而抑制其光合作用。此外，TYN降低了铜绿微囊藻和羊角月牙藻的生长性能和增殖能力。
羊角月牙藻是经济合作与发展组织(OECD)推荐的生态毒理试验模式藻类，因为它分布全球，生长迅速，对有毒物质敏感。此外，已经完成了羊角月牙藻全基因组测序，并研究了暴露在抗生素中的分子机制。在本研究中，我们利用转录组和代谢组的综合分析来揭示TYN暴露下羊角月牙藻生长抑制的潜在分子机制。本研究发现，在TYN胁迫下，羊角月牙藻生长抑制与光合作用、DNA复制和能量代谢相关的分子通路失调有关。
技术路线
研究结果
1. TYN对羊角月牙藻生长的影响
在本研究中，以3μg L-1（低处理组）和400μg L-1（高处理组）浓度的TYN处理羊角月牙藻7天(图1)。处理4天后，高TYN处理组的羊角月牙藻相比于对照组减少了67.8%。处理7天后，低处理组和高处理组的生长均受到显著抑制，相比于对照组分别减少了26.3%和58.3%。
图1 不同浓度TYN处理7天后的羊角月牙藻生长曲线
2.差异表达基因
相关分析表明，各处理组重复间具有良好的一致性，各处理组3个重复中基因表达的相关系数均大于0.99(图2A)。值得注意的是，相同处理组的重复样本在PCA中有很好的聚类，其中PC1和PC2分别解释了93%和4%的变异(图2B)。与相关分析和PCA的结果一致，heatmap显示低TYN处理和对照的基因表达模式非常相似，但与高TYN处理的基因表达模式有明显的不同(图2C)。与对照组相比，低、高TYN处理组分别检测到上调差异表达基因329、2383个，下调差异表达基因248、3055个（图2D）。
图2 不同浓度的TYN处理后，羊角月牙藻的转录组分析
3.GO、KEGG富集分析
在GO分析中，低、高TYN处理组分别富集了720和3095个GO条目。KEGG代谢途径分析显示，在低TYN处理组，DNA复制、同源重组和光合作用等8条途径受到显著影响；相比之下，高TYN处理组发生改变的15条通路中，主要为光合天线蛋白、DNA复制、脂肪酸生物合成、光合生物体固碳和光合作用等（表1）。
表1 TYN处理后，各处理组与对照组相比显著富集的代谢通路
4.代谢组学分析
在正离子和负离子模式下分别检测出355和415个代谢物。与对照组相比，在负离子模式下，低、高处理组分别鉴定出57和84个差异代谢物；在正离子模式下，低、高处理组分别鉴定出40和94个差异代谢物。
对所有差异代谢物合并进行KEGG富集分析表明，低、高处理组分别富集到5个和6个显著差异代谢通路。在两个处理组中代谢途径，次生代谢物的生物合成，细菌分泌系统和光合作用都显著富集。
5.转录组学和代谢组学联合分析
对转录本和代谢产物的综合分析表明，与对照组相比，低、高处理组共发现18个和52个差异代谢物与至少一个转录本配对（表2）。例如，在低TYN处理组中，差异代谢物及其相关基因腺苷(cmpk1)、磷酸(ap1_2)、腺苷酸(E3.1.3.5)、棉子糖(E2.4.1.82)等在嘧啶代谢、嘌呤代谢、半乳糖代谢等通路中均有相同的上下表达趋势。而在高TYN处理组中，磷酸(metK)、丙酮酸(ppdK)、乙酰辅酶a (dld)、尿嘧啶(psuG)等在半胱氨酸和蛋氨酸代谢、光合生物体固碳作用、柠檬酸循环、嘧啶代谢等代谢通路中表达趋势相同。
表2 处理组中差异代谢物与相应转录本的关联
讨论
本研究揭示了TYN对羊角月牙藻的毒性分子机制。与我们的假设一致的是，在低和高TYN处理组中，TYN显著改变了与DNA复制、光合作用和能量生产相关的分子通路。在TYN及其衍生物的长期胁迫下，暴露于TYN下的藻类生长抑制可能是由于光合作用抑制、诱导氧化应激、DNA复制耦合修复增加和能量代谢失调等原因导致的。
1.藻类在TYN胁迫下解毒的相关基因
在藻类中，外源性化合物代谢包括生物转化(阶段I和阶段II)和运输(阶段III)。在本研究中，TYN处理后，参与这三个解毒阶段的基因在羊角月牙藻中大多下调。在I期，细胞色素P450 (Cyt P450)在低TYN和高TYN处理组均下调；此外，乙醇脱氢酶(adhs)、醛脱氢酶(aldhs)和短链脱氢酶(sdrs)仅在高TYN处理组下调。这些结果表明，高TYN处理组的解毒过程可能受到抑制。本研究中，低TYN处理组ABC转运蛋白家族A、G基因表达显著上调，而在高TYN处理组中显著下调。因此，在低TYN处理组中，这些基因的上调可能有助于TYN从藻类细胞中消除，降低TYN暴露引起的毒性;然而，在暴露于高水平TYN处理组中，这些基因的下调显著抑制了羊角月牙藻的生长。
2.与光合作用相关的分子途径
本研究中，高TYN处理组中光合作用天线蛋白、卟啉和叶绿素代谢以及光合生物的碳固定等信号通路受到显著影响。在低TYN和高TYN处理组中，光合作用信号通路均发生了显著变化。这些结果表明，高水平的TYN处理可能抑制了藻类叶绿素的生物合成和光采集信号。由于TYN诱导的光合抑制，活性氧(ROS)的过度产生可能导致氧化应激和生长抑制。参与C4循环过程的基因(ppc, got2, gpt, E1.1.1.39)下调，表明本研究中，在高TYN胁迫下，CO2的释放可能减少。在低和高TYN处理组中，丙酮酸、磷酸和ATP含量在代谢水平下降，海藻生长受到抑制。
3.与DNA复制耦合修复相关的分子途径
在本研究中，参与DNA复制过程的20个DEGs在高TYN处理组中持续下调，这一生物学过程可能是TYN导致藻类生长性能下降的原因(表1)。这些被下调的DEGs编码的蛋白质参与了DNA复制的不同阶段。编码核糖核酸酶H2的rnaseh2a和rnaseh2c的下调表明DNA复制的终止信号被抑制（表1）。DNA复制耦合修复的抑制可能导致细胞分裂的减少，DNA损伤的积累，以及潜在的基因组不稳定，这表明羊角月牙藻在高TYN处理组的生长性能下降。此外，代谢组学水平上ATP含量的降低可能与TYN胁迫下羊角月牙藻的DNA复制和修复有关。
4.与能量代谢相关的分子途径
本研究中，高TYN处理组的半乳糖代谢、糖酵解等碳水化合物代谢相关通路受到显著影响(表1)。在代谢水平上，两组TYN处理组的柠檬酸、正磷酸和ATP含量均明显下降。相比之下，高TYN处理组中乌头酸、丙酮酸和蔗糖含量降低，乙酰辅酶a含量增加。蔗糖、丙酮酸、柠檬酸和ATP含量的降低，暗示了烃类代谢的失调和能量生产的减少，从而导致藻类生长受到抑制。乙酰辅酶a作为烃类代谢和脂类代谢之间的关键中间体，进入柠檬酸循环并被氧化生成能量。因此，丙二酰辅酶a的积累表明，在高TYN处理组中，TCA循环的阻塞或脂肪酸氧化的增加。脂质代谢的失调可能导致ROS的过度产生、氧化应激的诱导和藻类生长的抑制。
文章小结
3μg L-1和400μg L-1的TYN影响了羊角月牙藻光合作用、DNA复制耦合修复和能量代谢相关的分子途径。与TYN在细菌中的作用模式（TYN与50S核糖体结合，抑制蛋白质合成）相反，光合作用信号通路是TYN对于羊角月牙藻毒性最敏感的靶点之一。而在高TYN处理中，生长抑制与光合系统、DNA复制耦合修复、烃类代谢、脂质代谢和氧化应激相关的分子途径有关。值得注意的是，即使在环境中浓度较低的情况下，TYN的持续存在也可能对初级生产者(如藻类)和食物链中较高营养水平的消费者造成不良影响。
本研究中转录组和代谢组的检测与数据分析以及转录组、代谢组联合分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。
