微藻资源非常丰富，然而迄今为止。已开发利用的微藻资源以及能成功地进行大规模生产的藻种都不多，这就需要进行新的藻种的分离和培养，从天然水域混杂的生物群中，运用一定的方法，把所需要的个体分离出来，而获得单种培养。另一方面，若藻种受敌害生物及其他杂藻的污染也要通过分离进行纯化。

一、采样

水样可以取自任何有可能生长所需单胞藻的水体，通常在海岸边退潮后留下的小水洼中或者在养殖场、盐场等地方的小水坑中，生长有适合静水培养的单胞藻类，而且比较纯。在实验场、育苗场的一些水池、水桶中都有可能出现比较纯的藻类。采样时要同时定水样的温度和盐度，供分离、培养时参考。

水样采回后，进行显微镜检查，如果需要分离的藻类比较多，可以立即进行分离。如果在水样中有需要的藻类，但是数量不多，就要进行预培养，待其繁殖起来后再分离。预培养可以用500mL的三角烧瓶，加人150mL的培养液。然后把经350目筛绢过滤的水样150mL接种进去，在一定的温度和光照下静止培养，每天摇动1-2次。用作预培养的培养液，可选择各类藻类通用的培养液配方或者同时采用几种不同藻类的培养液同时分别培养。预培养的培养液的浓度应小些，一般只用原配方的1/2或1/4。如果要分离的藻类的最适生长条件是已知的，那就在其最适的光照和温度下培养。如果不知其最适生长条件那就在人为设定的条件下培养，以便适应应用时的特定环境。

二、分离方法

1.微吸管分离法

用直径0.5cm、长35cm的普通玻璃管，在中央部分加热，拉长6-10cm，使玻璃管的直径缩小至0.06-01cm，把它折断后即成2个吸管。把一团棉絮塞进吸管的宽大一端，然后放入高压灭菌器中消毒。消毒后，再在酒精灯上加热吸管的细端。用镊子拉成细的微管，直径缩小至0.08-0.16mm即可。微吸管在水的瞬间，因毛细管的作用会入微量的水。将藻液水样放在凹玻片上，在显微镜下用微吸管仔细地吸出单个藻体，滴在载玻片上，在显微镜下确认是所要分离的单个藻体后，移入经灭菌的培养液中培养。

2.平板分离法

按所要分离的藻类的特性。选用合适的培养液，在培养液中加入1%-1.5%的琼脂。加热将琼脂溶化。加热后要加淡水补充蒸发掉的水分。然后，按照微生物学中固体培养基的制作方法倒平板、灭菌。

在无菌操作箱中，用接种针蘸取少量藻液。在固体培养基上划蛇形线，藻细胞就会散布在琼脂培养基的表面。

另一种使藻细胞散布在培养基表面的方法是用医用口腔喷雾器，将经稀释的藻液喷在培养基的表面。

将接种好的培养皿放在有适合的光照和温度的地方培养。一般经过十几天的培养就会在培养基上长出相互间隔的藻落。通过显微镜检查，找出所要的纯的藻落，再用已消毒的接种针从培养基上挑取藻体，移人经灭菌的培养液中培养。

3.水滴分离法

先将欲分离的萧液稀释、用徽吸管将少量藻液吸出，滴在载破片上。每张载玻片上可以滴数滴。水滴大小以在低倍显微镜下一个视野能包括整个水滴为准，在显微镜下逐个观察水样，挑选水滴中只有所要分离的单个藻体，而没有其他任何杂藻或小动物的，移入经灭菌的培养液中培养。

4.稀释分离法

用已消毒的试管5支，在第一支试管中加蒸馏水10mL，第二和第五支试管部加5mL,用高压蒸汽消毒，待冷却后，在第一支试管中滴入混合藻液1滴，充分震荡，使其均匀稀释，再用经毒的吸管从第一支吸管中吸取5ml到第二支吸管中。充分震荡后再取5mL到第三支试管中，如此直至第五个试管，再取5个已装有消毒的培界基的培养皿。加热使培养基熔化。待冷却而尚未凝固时，分别滴入5个试管中的藻液各1滴，用力震荡使藻液充分混人培养基中，等冷凝后将培养皿放在适合的条件下，直到培养基中出现藻落。在稀释适当的培养皿内，藻落和细菌群落会充分分离。再在无菌条件下将选取单个藻落接种到固体培养基的表面，再培养。重复数次，直至得到纯的藻落。

三、藻种的保存技术

微藻营养丰富，是鱼、虾、贝等经济动物人工育苗的基础，特别是海洋微菜，由于富含EPA和DHA，在许多方面受到人们的青睐。在微藻的培养和应用中，保种技术十分重要，它是微藻培养和进一步度用的基础和关键环节，由于藻种极易受污染，分离培养方法比较复杂而且耗时较长，因此，在微藻保种工作中要尽量减少接种次数，避免藻种被杂藻、细菌或原生动物污染，既能达到长期储藏种质的目的，又能维持藻种的活性。是微藻科研工作者努力的方向之一。本文就微藻保存的几种常用方法介绍如下。

1.继代法保存

继代保存法是目前普遍采用的方法，适用于一切藻种的保存。通常在常温或常低温进行。常温一般指15-25℃。常低温一般指0-15℃，藻种可接种在固体、液体或双相培养基中。接种后应首先放在适宜的光照条件下培养，待藻细胞生长繁随达到较高密度，可见明显的条状或块状的菌细胞群时，再移置低温、弱光的条件下保藏，保藏半年到1年后必质进行转接。此方法简单易行，但是保存时间短，而且继代频繁，容易发生污染和变异。

2固化保存法

固定化细胞(immobilindceb)是指将游离细胞埋在多糖或多聚化合物制成的网状支持物中，固定载体束缚藻种，影响其代谢过程，从而抑制细胞的生长和分裂。固定化微生物技术是在20世纪60年代固定化技术的基础上发展起来的，1978年以来，固定化技术就被用来作为延长光合细胞寿命的一种重要手段。但微藻存活时间从1个月到几年不等。

固定化保种技术对多数微藻是适用的，该法可以在常低温下实现对藻类的中期保存。培养保存时间较长，活化复苏快、技术设备简单，细胞外渗少，而且可用于次生代谢物质的生产。在一般的微藻实验室内都能进行。但固定化程序较复杂。大多数微藻在培养后期常会从胶珠中溢出。而且，现有的资料表明，某种固定化方法只适用一定种类的微藻，对于其他种类的微藻会有不同的反应，原因复杂，还需要做更深人，广泛的研究。这就给固定化保种技术的推广带来了一定的困难。

3.超低温保种技术

所谓超低温保存区别于其他低温概念的冰箱温度(4~-40℃)和干冰温度(-79℃)是指在液氮低温(-196℃)下保存。此时生物体的物质代谢和生长活动几乎完全停止。可是它们仍处于可逆的成活状态。

超低温保存法具有保持种质遗传稳定性、最大限度地减少污染、省去藻种的活力监测和繁殖更新等方面的优点。但对保护剂组合、浓度及降温升温速率有特殊的要求。且微毒的种类很多，生理状态各异，适宜的保存条件各不相同，找出不同微藻的超低温保种方法困难，而且不同的细胞要求不同类型、不同浓度的抗冻剂，至今还没有找出1种对所有种类都适用的保护剂。

4.浓缩低温保存技术

浓缩低温保存法是将藻液高密度培养后。采用物理、化学的方法浓缩1000倍左右。再低温保存。国外自20世纪80年代末开始就有对海洋经济微藻的浓缩方法和低温保存力法进行研究、取得了不少的研究成果，其中美国、英国和日本已有相应的产品(微藻浓缩细胞或称“藻膏”)向世

浓缩低温保存多用于海洋微藻。微藻浓缩液的生产，可以使海洋微藻的生产与使用保留一定的时间差。但相对保存时间较短。海洋微藻的抗逆原理还有待做更多的研究和探讨。

5.冷冻真空干燥保存法

冷冻真空干燥保存法是在极低温度下(-70℃左右)快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥，使藻种的新陈代谢活动处于高度静止状态。冷冻干燥保存法优点是微藻复苏效果好，保藏期内可避免其他杂菌污染，便于携带运输、易实现商品化生产;其缺点是操作繁琐、对设备要求高等。

6.低温甘油生理盐水法

在藻液中加入一定的甘油作为保护剂，同时加入一定的生理盐水，混匀后直接放置在 -20℃正负0.5℃冰箱放置保存。保存时间长，一般3年左右。低温甘油生理盐水法是对甘油原液保存法的改进。加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用。更有利于藻种的保存。

综上所述，单细胞藻类的保种技术尚没有发展成为一项成熟稳定的技术。许多问题还有待于我们去探索。开展微藻保种方面的研究工作。不但会填补微藻保种理论研究上的空白，还会在生产实践中发挥应有的作用。

本文参考自《海藻生物技术》