近期，Water Research发表了“ The widespread capability of methylphosphonate utilization in filamentous cyanobacteria and its ecological significance”研究论文。论文阐述了丝状蓝藻可利用甲基膦酸盐克服低磷限制，揭示膦酸盐的利用对水体好氧甲烷发生的贡献。
摘 要：膦酸酯是一类新近发现的生物可利用磷，其在水环境中具有广泛来源，是水体可溶性有机磷的重要组成。研究发现，部分海洋蓝藻可利用甲基膦酸为底物，在有氧条件下产生甲烷；但由于其甲烷排放模式数据的缺乏以及目前可利用膦酸酯蓝藻数目较少，这一过程对全球甲烷排放的贡献较受质疑。在本工作中，我们在前期完成淡水藻种库160株库存蓝藻基因组测序工作的基础上，结合公共数据库共收集2568个蓝藻基因组，对蓝藻门的膦酸酯降解(phosphonate degradation, phn)基因簇分布特征进行调查。结果显示，phn基因簇广泛分布于丝状蓝藻中，包括数个水华蓝藻属。对5株编码phn基因簇的蓝藻进行膦酸酯利用能力测试，确定4株可以甲基膦酸为唯一磷源维持细胞生长，明确了phn基因簇的编码与蓝藻甲基膦酸利用能力的相关性。对蓝藻甲基膦酸利用过程中甲烷释放模式进行追踪，确定整个生长周期均可产生甲烷；同时甲烷的释放主要发生在光周期，而正磷酸盐的添加则会显著抑制甲烷的释放，这些特征均与已报道的野外好氧甲烷发生观察一致。基于转录组分析结果，发现甲基膦酸作为磷源维持蓝藻非核糖体多肽合成的生态风险。本研究明确了普遍存在的基于蓝藻甲基膦酸盐利用甲烷排放的遗传基础，促进了蓝藻磷策略与水生生态系统膦酸酯生物转化的全面理解。
图1 研究图形摘要
研究背景
在水生生态系统中，蓝藻最易利用的磷是正磷酸盐等无机磷；当无机磷耗尽时，多数蓝藻可通过分泌碱性磷酸酶代谢溶解性磷酸酯(含C-O-P键，图2A、B)供磷。磷酸酯(phosphoester)与膦酸酯(phosphonate，图2C、D)共同构成了水体的总溶解性有机磷(dissolved organic phosphorus, DOP)。在膦酸酯中，磷原子为+3价，因此其亦构成了水体磷氧化还原循环中最主要的成分。水环境中膦酸酯的来源广泛，人工合成(如草甘膦、敌百虫等)与生物合成(如甲基膦酸与2-氨基乙基膦酸)是主要来源。研究发现，在海洋环境中，膦酸酯可占DOP的10-25%；而在部分淡水水体中，DOP中膦酸酯可达35%。
图2 几种常见的磷酸酯(A核酸，B磷脂)与膦酸酯(C甲基膦酸，D草甘膦)。图中红色虚线圈示C-O-P键；绿色实线圈示C-P键
C-P键化学结构稳定，可抵抗酶解、水解等，膦酸酯常被认为生物不可利用。随着研究的深入，越来越多的微生物被证实具有膦酸酯利用功能。目前已发现三类膦酸酯生物利用途径，包括非底物特异的C-P键裂解酶(C-P lyase)途径、与底物特异的氧化裂解(PhnY*Z,)与水解裂解(PalA, PhnX, PhnWAY)途径[1]。其中，C-P lyase途径是目前底物范围最广、研究最为透彻的通路；该通路主要由膦酸酯降解(phosphonate degradation, phn)基因簇完成，包括膦酸酯转运蛋白基因(phnC-E)、调节子基因(phnF)、C-P lyase复合体基因(phnG-M)与辅助蛋白基因(phnN-P)等。2006年，科学家在一株海洋固氮蓝藻束毛藻(Trichodesmium)基因组中发现该基因簇，并确定该藻株可高效利用膦酸酯供磷；蓝藻膦酸酯代谢能力的发现，显示了其对低磷环境的适应性进化，表明膦酸酯的蓝藻可利用性，深化了对海洋磷循环的认识[2]。
水生生态系统贡献了全球甲烷的主要来源。通常认为，甲烷的生物发生是基于产甲烷古菌(细菌)在严格厌氧条件下完成；但野外观察发现水体表层时常可观测到甲烷超饱和现象，暗示该水层存在高效、未知的好氧甲烷发生过程[3]。研究发现，蓝藻的甲基膦酸利用，可能是其中机制之一，贡献好氧甲烷发生[4]。但目前仅发现少数蓝藻藻株具有膦酸酯利用功能；同时对该过程甲烷排放模式的研究也较为缺乏；因此，这一过程对全球甲烷排放的贡献也受到了质疑。
本研究拟基于基因组比对，探究膦酸酯利用与生物合成基因(簇)在蓝藻门的分布特征；结合藻类培养，确定phn基因簇的编码与蓝藻膦酸酯利用能力相关性；以明确蓝藻在膦酸酯生物转化过程扮演的角色。同时，对蓝藻甲基膦酸利用过程的甲烷释放模式与转录水平响应进行追踪，解析该过程的生态风险。
研究结果
(1) 膦酸酯降解基因簇在蓝藻门的分布特征
首先，对已测序完成的淡水藻种库 [5]160株库存蓝藻基因组进行phn基因簇检索，确定8属37株蓝藻基因组编码相关基因簇，其结构如图3所示。当将搜索范围扩大到2568株蓝藻时，该数字到达31个属151株，其中9个属为首次报道含该基因簇；编码phn基因簇蓝藻包括拟柱孢藻、束毛藻、节球藻与鱼腥藻/长孢藻等常见水华蓝藻种类。对151条蓝藻C-P裂解酶基因phnJ进行系统发育分析，后进行蓝藻表型与生境注释，结果显示大部分(141/151 = 93.4%)含该基因簇蓝藻为丝状藻，仅8株为单细胞蓝藻。
图3 淡水藻种库37株蓝藻基因组中phn基因簇结构示意图。红色字体示该藻株同时编码参与膦酸酯生物合成的pepM与ppd基因
(2) 膦酸酯生物合成功能在蓝藻门的分布特征
对上述2568个蓝藻基因组数据集进行膦酸酯生物合成关键酶PepM与Ppd [1]同源比对，确定13属81株蓝藻编码上述基因，包括念珠藻、鱼腥藻、浮丝藻与眉藻等蓝藻属；其中7属11株藻同时编码phn基因簇(图4)。对81条蓝藻磷酸烯醇式丙酮酸变位酶基因pepM进行系统发育分析与蓝藻表型与生境注释，确定其中79株为丝状蓝藻，显示了丝状藻在膦酸酯代谢中的重要作用。
图4 蓝藻C-P lyase基因phnJ最大似然法系统系统发育树。内圈：藻株来源生境注释；中圈蓝藻表型注释；外圈：膦酸酯生物合成潜能注释
(3) 藻类培养实验明确phn基因簇编码与蓝藻膦酸酯利用能力相关性
选取淡水藻种库5株编码phn基因簇蓝藻开展膦酸酯利用实验，包括鱼腥藻FACHB-418(PCC 7120)、发状念珠藻FACHB-838，无菌念珠藻FACHB-892，无菌小颤藻FACHB-1052与无菌假鱼腥藻PCC 6802；以一株不含phn基因簇的无菌铜绿微囊藻PCC 7806为对照。分别将磷饥饿的上述藻株置于4种磷条件下培养(无磷、甲基膦酸、草甘膦与正磷酸盐)。实验结果显示，4株编码phn基因簇蓝藻可高效分解甲基膦酸供磷(图5)，表明相关基因簇的编码与蓝藻膦酸酯利用能力存在较强相关性。所有蓝藻都显示草甘膦抗性，但仅FACHB-838与PCC 7806可轻微利用该物质，显示phn基因簇的编码与草甘膦的利用能力关系不大。
图5 六株蓝藻菌株对4种磷处理的生长响应。除PCC 7806外，所有藻株均编码phn基因簇；FACHB-892同时编码膦酸酯生物合成相关基因。*: P < 0.05; **: P < 0.01
(4) 蓝藻基于甲基膦酸利用的甲烷释放特征
选取三株蓝藻进行生长周期甲烷排放能力测试，包括无菌念珠藻FACHB-892，无菌小颤藻FACHB-1052与无菌假鱼腥藻PCC 6802。实验结果显示，三株藻在整个生长周期均可高效代谢甲基膦酸释放甲烷，同时正磷酸盐的添加可大幅降低甲烷排放速率(图6a)。在12h:12h光暗比条件下，对无菌念珠藻FACHB-892与无菌假鱼腥藻PCC 6802进行36小时甲烷积累实验，结果显示蓝藻对甲基膦酸的代谢多集中于白天；在夜晚则减弱，表现在甲烷释放速率减缓(图6b,c)。上述甲烷释放特征与已报道的多个好氧甲烷发生特征一致，暗示这一过程对水体好氧甲烷发生的贡献。
图6 蓝藻基于甲基膦酸代谢的甲烷释放模式。a: 蓝藻28天生长周期的甲烷释放模式；D12+0为甲基膦酸正常培养12天后，添加0.2mM总浓度正磷酸盐；D12+1为添加0.2mM总浓度正磷酸盐后24小时，*: P < 0.05; **: P < 0.01.。b和c: 两株藻的36h甲烷积累模式；灰色阴影示暗期
(5) 蓝藻甲基膦酸利用过程的转录组学分析
对一株同时编码phn基因簇与膦酸酯生物合成相关基因的藻株，念珠藻FACHB-892的甲基膦酸利用过程进行转录组分析，共设置4种磷处理：正常BG-11培养基培养(Control)，BG-11缺磷培养基培养10天(P depletion)；将磷饥饿的培养液置于添加0.2mM终浓度甲基膦酸的BG-11 缺磷培养基培养15天(MPn)；在MPn处理藻液中添加0.2mM正磷酸盐，24h后取样(MPn P-complement)。
转录组结果显示，由缺磷引起的光系统Ⅰ 、光系统Ⅱ与光合作用天线蛋白相关基因的下调，在添加甲基膦酸后均恢复；但磷限制相关基因如高亲和力磷转运蛋白基因(pstSCAB)、碱性磷酸酶基因 (phoA, phoD)等的上调并未恢复。正磷酸盐的添加显著抑制了phn基因簇的表达。本研究还鉴定到一个在缺磷处理下被显著抑制的非核糖体多肽合成酶基因簇，其表达在在添加甲基膦酸后显著恢复，提出了甲基膦酸在维持蓝藻毒素合成基因簇表达方面可能存在生态风险。
图7 以对照组相比，念珠藻FACHB-892的非核糖体肽合成酶基因簇簇(a)与phn基因簇(b)在三种处理下的转录组响应
总结与展望
√ 丝状蓝藻是膦酸酯分解代谢和生物合成的重要驱动力，在不同生态系统中参与磷氧化还原循环；
√ 多数携带phn基因簇的蓝藻可以甲基膦酸为唯一磷源维持细胞生长，同时释放甲烷；本结果支持了蓝藻基于甲基膦酸代谢对好氧甲烷发生的贡献，但具体甲烷排放通量及其对全球气候变化的影响需要继续探究；√ 甲基膦酸是部分蓝藻的可选择性磷，以维持磷胁迫下细胞稳态与非核糖体多肽合成；
√ 本工作进一步证实了蓝藻在全球磷循环中的重要作用，并呼吁重新评估蓝藻膦酸酯利用的生态风险。
研究团队及项目资助
论文第一作者赵亮博士来自华南师范大学和中国科学院水生生物研究所。华南师范大学束文圣教授、中科院水生生物研究所宋立荣研究员、暨南大学韩博平教授为论文的共同通讯作者。该研究得到国家自然科学基金项目（31900090，32061143029与41830318）和广东省重点领域研发计划项目（2019B110205004）资助。
本文转载自国家水生生物种质库淡水藻种库微信公众号
