The following article comes from Mol Plant植物科学

光合生物中大多数基因的功能仍未被确定。2022年5月5日，美国普林斯顿大学、卡内基科学研究所等多家单位的科研人员在Nature Genetics发表了题为“Systematic characterization of gene function in the photosynthetic alga Chlamydomonas reinhardtii”的研究论文，通过莱茵衣藻的突变体库鉴定了超过58000个突变体在121种不同生长条件或处理下的表型特征，为数千个光合作用基因的功能提供了线索，对生命树中基因的功能表征具有重要参考价值。

莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是一种单细胞绿藻，已作为模式生物广泛应用于光合作用、初级代谢、细胞通信、应激反应以及纤毛相关的研究。虽然CRISPR技术的发展促进了靶向突变体的产生，但衣藻中较低的编辑效率阻碍了大规模CRISPR sgRNA文库筛选。衣藻条形码突变体库的构建有助于对单个基因进行研究，并使正向遗传筛选成为可能。本研究中，利用莱茵衣藻对高通量方法的适应性，大规模确定了基因型与表型的对应关系，从而分析了相应基因所参与的通路，并发现了同样在陆生植物中保守的基因功能。

图1 单细胞真核光合生物中大规模发掘基因型-表型的对应关系

为确定基因型与表型的关系，研究测定了代表14695个基因（已知基因组中编码基因的83%）的58101个衣藻突变体在121种环境和胁迫条件下的生长情况。将衣藻突变体库整体转移至液体培养基中，通过分子条形码量化竞争生长后每个突变体的相对丰度。生长条件包括不同光子通量密度和CO₂浓度下异养、混合营养和光合自养生长，以及不同pH和温度的非生物胁迫条件；化学胁迫则包括DNA损伤剂、活性氧、巴龙霉素和壮观霉素等抗生素以及LatB等肌动蛋白聚合抑制剂。此外，研究还从拟南芥活性化合物文库（LATCA）中鉴定出1222个对衣藻生长产生负面影响的小分子化合物，并在52种最有效化合物存在条件下进行了竞争生长实验。

图2 121种生长条件下58101个衣藻突变体的适应度

为鉴定特定处理条件下表现出生长缺陷或增强的突变体，研究比较了不同处理条件与对照条件下的生长后丰度，这一比较过程称为“筛选（screen）”，每个突变体在不同条件下的生长后丰度称为“突变表型（mutant phenotype）”。突变体个体表现出基因型-表型特异性，突变体库中共有10380个基因（衣藻基因的59%）具有一个或多个在5’UTR、CDS或内含子区的插入突变体，虽然仅通过一个表型存在差异的突变体不足以最终建立基因-表型的对应关系，但这一突变体库具有以下三方面作用，1）有助于优先确定通过转录组学、蛋白质互作等其他方式鉴定的候选基因的相关特征；2）有助于提出关于尚未表征的基因功能的相关假说；3）有助于优先确定现有突变的等位基因以便进一步研究，包括通过回补和/或回交确定基因-表型关系。

图3 该方法新发现了一种抗细胞骨架抑制剂的防御机制的保守成分

当同一基因的多个独立突变的等位基因表现出相同表型时，将提高基因-表型对应关系的可信度。研究鉴定了684个基因的1218个可信度较高的基因-表型关系，并基于相应表型建议命名了89个新基因。由于具有相似表型的突变参与同一通路的可能性更高，研究将684个高可信度基因进行了聚类，根据聚类中存在的已被表征基因或最显著表型对部分聚类进行了命名，包括DNA修复、光敏感、低CO₂敏感、纤毛膜组成调节、F-肌动蛋白稳定等。
综上所述，本研究构建了迄今为止所有光合生物中最大规模的突变体库，确定了58101个衣藻突变体在不同生长条件下的表型，对代表10380个基因的突变体表型进行了观察。这项工作说明衣藻等光合微生物在大规模基因功能研究中具有重要价值，研究中确定的基因-表型关系将为数千个基因的表征提供参考，在农业生产、全球碳循环以及细胞生物学的基本认识等方面应用潜力巨大。

本文转载自水圈植物科学微信公众号