结论: 褐藻胶寡糖通过调控miR-34a改善线粒体功能和氧化应激的作用延缓D-gal诱导的心肌细胞衰老。
验证方法：
实验分六组：对照（Control）组、模型（D-gal）组、D-半乳糖+褐藻胶
寡糖（D-gal +AOS）组、褐藻胶寡糖（AOS）组、D-半乳糖+褐藻胶寡糖+microRNA-34amimic（D-gal+AOS+miR-34a mimic）组、D-半乳糖+褐藻胶寡糖+microRNA-NegativeControl （D-gal+AOS+miR-NC）组。D-gal+AOS+miR-34a mimic 和D-gal+AOS+miR-NC 组分别用 LipofectamineTM3000 转染 miR-34a mimic（50nM）和 miR-NC（50nM），4-6h 后换液。D-gal、D-gal +AOS、D-gal+AOS+miR-34a mimic和 D-gal+AOS+miR-NC 组细胞用 D-ga（l200mM）干预 48h 诱导心肌细胞衰老模型。48h 后 D-gal +AOS、AOS、D-gal+AOS+miR-34a mimic 和 D-gal+AOS+miR-NC 组用AOS（100μg/mL）干预细胞 48h，Control 组给予同步换液处理。待细胞干预结束后，用 β-半乳糖苷酶染色法检测衰老心肌细胞数目；RT-PCR 检测 miR-34a 的表达；线粒体膜电位检测法检测线粒体膜电位的变化；Western blot 检测衰老相关蛋白 p16、
p21 和 p53 的表达， SIRT1 和 PGC1α 蛋白的表达，氧化应激相关蛋白 p47 phox 和gp91 phox 的表达；免疫共沉淀法检测 SIRT1 与 PGC1α 之间的相互作用；RT-PCR检测 SIRT1 和 PGC1α mRNA 的表达。
结果：1. β-半乳糖苷酶染色结果显示：与 Control 组相比，D-gal 组 β-半乳糖苷酶染色阳性率明显增加，差异有统计学意义（p<0.01）；与 D-gal 组相比，AOS 干预后 β-半乳糖苷酶染色阳性率明显降低，差异有统计学意义（p<0.01）；与D-gal+AOS+miR-NC 组相比，D-gal+AOS+miR-34a mimic 组 β-半乳糖苷酶染色阳性率明显增加，差异有统计学意义（p<0.01）。
2. miR-34a 的表达结果显示：与 Control 组相比，D-gal 组 miR-34a 的表达明显增加，差异有统计学意义（p<0.01）。与 D-gal 组相比，AOS 干预后 miR-34a 的表达明显减少，差异有统计学意义（p<0.01）。与 D-gal+AOS+miR-NC 组相比，D-gal+AOS+miR-34a mimic 组 miR-34a的表达明显增加，差异有统计学意义（p<0.01）。
3. 线粒体膜电位检测结果显示：与 Control 组相比，D-gal 组线粒体膜电位下降，差异有统计学意义（p<0.01）；与 D-gal 组相比，AOS 干预后可使线粒体膜电位升高 ， 差 异 有 统 计 学 意 义 （ p<0.01 ） ；与 D-gal+AOS+miR-NC 组 相 比 ，D-gal+AOS+miR-34a mimic 组线粒体膜电位明显下降，差异有统计学意义（p<0.01）。
4. Western blot 结果显示：与 Control 组相比，D-gal 组心肌细胞衰老相关蛋白 p16、p21、p53 表达明显增加，差异有统计学意义（p<0.01）；与 D-gal 组相比，AOS 干预后使衰老相关蛋白 p16、p21、p53 表达明显降低，差异有统计学意义（p<0.01）；与 D-gal+AOS+miR-NC 组相比，D-gal+AOS+miR-34a mimic 组心肌细胞衰老相关蛋白 p16、p21、p53 表达明显增加，差异有统计学意义（p<0.01）。
5. Western blot 结果显示：与 Control 组相比，D-gal 组 SIRT1 和 PGC1α 蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（p<0.01）；与 D-gal 组相比，AOS 干预后 SIRT1和 PGC1α 蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（p<0.01）；与 D-gal+AOS+miR-NC组相比，D-gal+AOS+miR-34a mimic 组 SIRT1 和 PGC1α 蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（p<0.05）。
6. 免疫共沉淀结果显示：与 Control 组相比，D-gal 组 SIRT1 和 PGC1α 结合减少，降低了线粒体生物合成功能；与 D-gal 组相比，AOS 干预后 SIRT1 和 PGC1α 结合增加 ， 改 善 了 线 粒 体 生 物 合 成 功 能 ；与 D-gal+AOS+miR-NC 组 相 比 ，D-gal+AOS+miR-34a mimic 组 SIRT1 和 PGC1α 结合减少。
7. Western blot 结果显示：与 Control 组相比，D-gal 组氧化应激相关蛋白 p47 phox和 gp91 phox 表达明显增加，差异有统计学意义（p<0.05）；与 D-gal 组相比，AOS干预后可降低氧化应激相关蛋白 p47 phox 和 gp91 phox 的表达，差异有统计学意义（p<0.01）；与 D-gal+AOS+miR-NC 组相比，D-gal+AOS+miR-34a mimic 组氧化应激相关蛋白 p47 phox 和 gp91 phox 的表达明显增加，差异有统计学意义（p<0.05）。
8. SIRT1 和 PGC1α mRNA 的表达结果显示：与 Control 组相比，D-gal 组 SIRT1和 PGC1α mRNA 的表达明显降低，差异有统计学意义（p<0.01）；与 D-gal 组相比，AOS 干预后SIRT1 和PGC1α mRNA的表达明显增加，差异有统计学意义（p<0.01）；与 D-gal+AOS+miR-NC 组相比，D-gal+AOS+miR-34a mimic 组 SIRT1 和 PGC1αmRNA 的表达明显降低，差异有统计学意义（p<0.01）。
引 言
根据联合国报告的数据结果显示，至 2050 年全球老年人口数目将超过 20 亿，随之而来的是衰老相关心血管疾病（慢性心力衰竭、冠心病和高血压等）的发病率逐年增加。心脏老化被认为是衰老相关心血管疾病发生发展的独立危险因素，其特点是增龄性的结构退行性改变及储备功能降低。美国老龄化研究所研究结果显示，约有 40％的老年人（65 及 65 岁以上）死于心血管疾病。近年来研究发现与青年人群相比，50-80 岁之间的人群心血管疾病发病率增加了 10 倍，并且严重影响了老年人的生活质量。心脏属于高氧耗及高新陈代谢器官，其功能正常运作依赖于细胞能量稳态的维持。
线粒体是细胞能量的主要生产者也是细胞内稳态的重要决定因素。衰老导致心肌细胞线粒体数量减少、功能障碍和通透性改变等使心脏氧供减少进而导致心脏功能障碍。线粒体功能障碍是心脏老化的重要标志，也是导致衰老相关心血管疾病发生发展的主要因素。线粒体不仅是活性氧（ROS）的重要来源同时也是 ROS 损伤的主要靶点，ROS 聚积可损伤线粒体 DNA、胞浆蛋白和胞膜蛋白等细胞组分，继而使线粒体膜电位下降，最终导致线粒体功能障碍。由于心脏的高能量需求及高密度的线粒体致使心脏更容易受到线粒体功能障碍的影响。研究表明，氧化应激与衰老进程有关，氧化应激的增加导致 ROS 产生增加。衰老的自由基学说认为衰老机体内 ROS 逐渐堆积及机体对其清除能力的下降加剧了氧化应激的发生，进而释放更多 ROS 物质从而陷入氧化应激逐渐增强的“恶性循环”中。研究发现，老化心肌中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶等产生的 ROS 是 ROS 的重要来源之一。
microRNA（miRNA）是一类长约 22 个核苷酸的内源性短链非编码 RNA，已被证明可调控多种基因表达，是一种新型衰老及衰老相关疾病的调控靶点。研究发现，miRNA 成为衰老心血管相关疾病的关键调节因子。miRNAs 微阵列结果显示，miR-34a 在老年人心脏中表达明显上调，并且当沉默 miR-34a 后老年小鼠心肌细胞死亡数量明显减少。同时研究发现 miR-34a 过表达后可通过降低 SIRT1 蛋白的表达进而促进内皮细胞衰老。
褐藻胶是由马尾藻、海带、巨藻等褐藻加工而成的酸性多糖，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学活性。褐藻胶寡糖（Alginate Oligosaccharide，AOS）是由褐藻胶降解而形成的海藻寡糖，是一种高分子碳水化合物。AOS 由 α-L-古罗糖醛酸（Guluronic acid，G）和 β-D-苷露糖醛酸（Mannuronic acid，M）通过糖苷键连接而成的化合物，具有无免疫原性、无毒性、可生物降解等特点。研究发现，AOS对阿茨海默病等神经退行性疾病具有保护作用，其机制可能与 AOS 抑制氧化应激有关。AOS 可抑制 H2O2诱导的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞线粒体氧化应激水平，其机制可能与促进抗氧化酶表达、抑制细胞内氧化应激发生有关。已有学者研究发现 D-半乳糖（D-galactose，D-gal）是一种还原糖，其诱导的亚急性衰老模型广泛应用于模拟自然衰老进程，为研究衰老相关机制和抗衰老药物药理机制研究奠定基础。D-gal 正常剂量下可代谢为葡萄糖，过量时在体内蓄积导致 ROS增加，进一步引起线粒体功能障碍、氧化应激和细胞损伤等衰老相关改变。本研究建立 D-gal 诱导大鼠 H9c2 心肌细胞衰老模型，探讨 miR-34a 在 AOS 延缓 D-gal 诱导的 H9c2 心肌细胞衰老中的作用及可能的机制，为延缓心肌细胞衰老提供新靶点和理论依据。
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