研究背景
生物固氮是指原核微生物利用固氮酶将大气中的氮气还原成氨的过程。近几十年的研究表明，海洋环境中绝大部分的固氮生物是蓝藻，而在陆地生态系统中，蓝藻是土壤沙漠结皮中生物氮源的主要供给者，其生物固氮作用对氮元素生物地球化学循环具有重要意义。但现阶段仍缺乏对蓝藻固氮酶的多样性、起源及其进化历史的系统性研究，关于蓝藻协调遇氧失活固氮过程和光合产氧过程的适应性机制仍有待深入研究。
本研究以650株具有谱系代表性的蓝藻基因组作为基础数据，利用保守的固氮酶编码基因（nifHDKENB）评估蓝藻的固氮潜力，厘清生物固氮功能在蓝藻各类群的分布特征；利用系统发育分析及固氮性状祖先态重建分析，揭示固氮功能在蓝藻的起源以及其在各类群间的演化模式；通过关联多细胞演化与固氮性状演化，结合基因富集分析，部分揭示蓝藻协调遇氧失活固氮过程与光合产氧过程的适应性进化的分子机制。
研究结果
（1）固氮基因簇在蓝藻门的分布特征
通过对650株蓝藻基因组进行检索，我们确定了266株蓝藻基因组编码固氮酶相关的基因簇（nif基因簇，图1）。将固氮蓝藻对应到蓝藻的系统发育框架树上，我们发现nif基因簇在各个蓝藻类群的分布不均，其中nif基因簇在能形成异形胞或真分支的念珠藻目(Nostocales)基因组中广泛存在（在181个高质量基因组中，158个基因组具有nif基因簇），而在以单细胞蓝藻为主的聚球藻目（Synechococcales）中较为少见（在181个高质量基因组中，仅有39个基因组具有nif基因簇）。
此外，nif基因簇在不同形态的蓝藻藻株的分布不均，在147个单细胞蓝藻高质量基因组中，仅有26个基因组具有nif基因簇；在158个不能形成异形胞的丝状蓝藻高质量基因组中，有58个基因组具有nif基因簇。这一结果表明在不同谱系类群，不同表型形态的蓝藻中，具有生物固氮功能蓝藻的比例具有显著差异。
图1 固氮蓝藻的系统发育分布（内圈为蓝藻的形态分类，外圈的圆点代表含有nif基因簇的蓝藻基因组）
（2）古老的基因获得与扩张事件及蓝藻的多细胞化驱动了固氮蓝藻的起源与演化
基于预测的各藻株的固氮性状，结合蓝藻系统发育框架，对蓝藻固氮性状进行祖先态重建。结果表明，蓝藻的最后共同祖先（last common ancestor of Cyanobacteria）不具有固氮功能，固氮功能在蓝藻早期类群演化中产生，且在后期演化过程中固氮功能丢失的速率显著高于固氮功能获得的速率（图2）。类似地对蓝藻的细胞形态性状进行祖先态重建，研究发现蓝藻固氮性状起源的节点与蓝藻多细胞起源的节点相一致，暗示着这两个过程的同步进行；相关性检验结果表明，蓝藻的固氮功能演化依赖于蓝藻多细胞化的演化过程，进一步说明蓝藻的多细胞化可能是蓝藻生物固氮起源的重要驱动因素。
此外，基因家族分析结果表明，大量的基因家族获得与扩张事件发生在蓝藻固氮性状起源的节点，对新获得或扩张的基因进行功能注释发现，许多基因功能与已报道的固氮蓝藻的生物特性相一致，如获得与铁和钼摄取、调控、运输相关的基因（fur, efeU, feoB, afuA and mopA），该结果也暗示着早期基因家族的获得与扩张可能促进了非固氮蓝藻向固氮蓝藻的转变。
图2 蓝藻生物固氮性状重建结果示意图（图中灰色分支表示该藻株不能固氮，橙色分支表示该藻株为固氮蓝藻，黑色分支表示该藻种在对应节点固氮能力仍不确定。树中彩色圆圈表示特征性状转换。图中各大节点旁边数字代表在该节点发生的基因获得和丢失事件数量。图中生物固氮功能的起源被标注在节点8，蓝藻由单细胞向多细胞的转换也发生在同一个节点。右下图显示蓝藻固氮功能演化与多细胞演化的相关性检测结果）
（3）跨门的水平基因转移事件使部分蓝藻具有在厌氧细菌中发现的II型固氮酶
通过比较nif基因簇各基因的基因树拓扑结构与蓝藻的系统发育树结构，研究发现13株蓝藻的nif基因簇与其余具有固氮功能蓝藻的基因簇具有显著区别。为了证实这些基因簇的来源，本研究从公共数据库中下载了nifHDK三个基因的蛋白序列，结合本研究预测的蓝藻nifHDK蛋白序列构建基因树，结果显示蓝藻的固氮基因序列在基因树上不单系，分散为两支（图3），其中一支包含了绝大多数固氮蓝藻的基因序列，另外一支则包含了上述的13个基因组的序列，该支与少数厌氧变形菌（Proteobacteria）序列成为姐妹类群。此外，研究发现这13个基因组的nif基因簇与在厌氧细菌中发现的II型固氮酶基因簇具有多种相似特征，其中包括在nifH下游区域有nifI1 和 nifI2两个基因，此前这两个基因仅在II型固氮酶基因簇中有报道。由此多项证据表明，跨门的水平基因转移事件在厌氧变形菌与蓝藻间发生，部分蓝藻从厌氧细菌处获得了与II型固氮酶相似的固氮基因簇。
图3 nifH基因树揭示跨门的固氮基因水平转移事件（图中蓝藻序列被分为两支，序列稀少的那一支与厌氧放线菌为姐妹类群。右下红色框标注为序列稀少的固氮蓝细菌基因簇中具有的II型固氮酶基因簇特征序列nifI1和nifI2）
（4）蓝藻生物固氮过程有关的分子适应性特征
与不具有固氮基因簇的蓝藻基因组相比，固氮蓝藻基因组富集了多个在厌氧条件下参与物质合成与代谢的基因，包括编码不依赖于氧的原卟啉氧化酶3 （hemN）, 厌氧核糖核苷酸还原酶小亚基（NrdG）和氧敏感的丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（nifJ）基因, 这些基因的富集反映了蓝藻适应对氧敏感的生物固氮过程 (图4)。研究还发现参与铁和钼酸盐转运的基因在固氮基因组中富集，这类基因的富集满足了光合作用和生物固氮对铁、钼金属的高需求。
此外，本研究还进一步地将固氮基因组分为能形成异形胞的固氮蓝藻基因组与不能形成异形胞的固氮蓝藻基因组两组，并与相对应的不具有固氮基因簇的基因组进行比较。研究发现，能形成异形胞和不能形成异形胞的固氮蓝藻均有其独特的适应性分子特征。例如，编码硫化醌氧化还原酶的基因（sqr）在不能形成异形胞的固氮蓝藻基因组中富集，而在形成异形胞的固氮蓝藻基因组中未发现此现象。研究推测这主要是由于不能形成异形胞的固氮蓝藻没有营养细胞进行光合作用为生命体维持和固氮过程提供能量，使得这类蓝藻通过另一渠道，利用硫化醌氧化还原酶以硫化物为电子供体进行不产氧的光合作用，为生物体的正常活动与固氮过程提供能量。
图4 固氮蓝藻富集途径示意图（图中土色方块标注的是形成异形胞的固氮蓝藻富集基因，棕色方块标注的是不能形成异形胞的固氮蓝藻富集基因）
总结与展望
本研究发现固氮蓝藻的系统发育分布不均，频繁的固氮性状丢失事件造成了现在观测到的固氮蓝藻的零散分布。在固氮蓝藻中，存在两种不同类型的固氮基因簇，一种为祖先型，由固氮蓝藻祖先垂直遗传到各个类群；另一种为厌氧菌型，拥有这种类型的蓝藻数量稀少，其可能通过水平基因转移从厌氧细菌中获得。
本研究阐明了蓝藻固氮功能的起源与两个主要的进化事件相吻合，其一是蓝藻多细胞的起源，其二是大量基因家族的获得和扩张事件，该结果揭示了它们是驱动蓝藻从非固氮蓝藻向固氮蓝藻演化的关键因素。
此外，本研究发现与无氧光合电子传递(sqr)以及无氧代谢(nifJ、hemN、nrdG) 有关的基因在固氮蓝藻基因组中富集，反映了固氮蓝藻协调遇氧失活固氮过程与光合产氧过程的适应性进化的分子机制。
研究团队及项目资助
本研究由华南师范大学、中国科学院水生生物研究所、暨南大学合作完成，华南师范大学陈梦云博士为论文第一作者，华南师范大学束文圣教授、中科院水生生物研究所宋立荣研究员、暨南大学韩博平教授为论文的共同通讯作者。相关研究结果以“Phylogenomics uncovers evolutionary trajectory of nitrogen fixation in Cyanobacteria”为题发表在国际知名期刊Molecular Biology and Evolution.
该研究得到国家自然科学基金项目(31900002，41830318)、中国博士后科学基金项目(02021M701275)、广东省自然科学基金项目(2022A1515010464)的资助。本研究数据集中163株蓝藻来自国家水生生物种质资源库-淡水藻种库。
本文转载自国家水生生物种质库淡水藻种库微信公众号
