近日，中国海洋大学藻类生物技术与遗传育种实验室隋正红教授团队的研究成果“CRISPR/LbCas12a-mediated targeted mutation of Gracilariopsis lemaneiformis (Rhodophyta)”在线发表在知名期刊Plant Biotechnology Journal，报道在大型海藻龙须菜中实现CRISPR/LbCas12a基因编辑。基因编辑对遗传育种具有重要意义，为龙须菜的基因功能研究提供了重要的技术手段。

CRISPR/LbCas12a系统是一种高效的基因编辑手段，目前已经成功地应用于多个物种中，实现了基因敲除、激活或抑制。由于大型海藻特殊的生物学特性，目前尚未有成功实现基因编辑的报道。

文章首次报道了在重要经济红藻龙须菜中基于CRISPR/LbCas12a基因编辑系统实现目标基因的突变，通过利用基因枪直接转化蛋白质核酸复合体的方法，简化了实验流程；同时证实了单链构象多态性分析有助于在大量野生型细胞中筛选编辑结果。该研究为其他大型海洋藻类基因编辑技术构建提供了重要参考。

该研究首先针对龙须菜的一种胞外碳酸酐酶基因设计了6个靶位点，并在体外验证了针对这6个靶位点的gRNA效率。在这6个靶位点中挑选了两个效率最高的gRNA，并将它们分别与LbCas12a蛋白孵育形成蛋白质核酸复合体（RNP），使用基因枪分别将各RNP轰击转化进龙须菜藻尖中。培养5天后，PCR扩增碳酸酐酶基因，通过单链构象多态性分析（SSCP）将疑似突变的片段富集后进行单克隆测序，检测到了发生在靶位点附近的碱基替换结果。

图1 选定位点的荧光观察

图2 PAM上游200个碱基附近的突变序列

为了能够直观地区分转化细胞和正常细胞，该研究又选择了藻红蛋白的γ亚基作为靶基因。针对每一个藻红蛋白的γ亚基基因，分别设计了两个靶位点并进行体外效率验证。将所有靶位点中效率最高的一个gRNA与Cas12a蛋白转化进入到龙须菜藻尖中。5天后，在荧光显微镜下观察到了龙须菜藻体表面转化细胞的自发荧光发生改变，形成了区别于正常细胞的“色斑”。通过单克隆测序检测到了靶位点附近的碱基替换及靶位点上游的碱基插入和缺失。

中国海洋大学海洋生命学院张敬宇、吴琼及Morgane Eléouët博士为论文的共同第一作者，隋正红教授和胡依依博士为共同通讯作者。这项工作得到了中国农业部产业技术体系和国家自然科学基金项目的资助。

本文转载自水圈植物科学微信公众号